ITP病家园_血小板减少性紫癜_针对血小板低出血预防护理

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[病友治疗交流] 血小板自身抗体的流式细胞仪检测与意义

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ITP病家园-新人

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发表于 2021-6-14 19:59:32 | 显示全部楼层 |阅读模式
    单位:韩悦(苏州医学院附属第一医院 江苏省血 液病研究所 江苏苏州,215006);王兆钺(苏州医学院附属第一医院 江苏省血 液病研究所 江苏苏州,215006);朱明清(苏州医学院重点实验室);王爱青(苏州医学院重点实验室);张威(苏州医学院附属第一医院 江苏省血 液病研究所 江苏苏州,215006);阮长耿(苏州医学院附属第一医院 江苏省血 液病研究所 江苏苏州,215006)(苏州医学院重点实验室)

    关键词:紫癜血小板减少性;特发性 血小板;自身抗体;流式细胞术;酶联免疫吸附试验

    临床血液学杂志000511 摘要 目的:应用流式细胞术(FCM)测定血小板自身抗体P AIgG,研究其对特发性血小板减少性紫癜(ITP)诊断的意义。方法:应用FCM检测20例ITP患者血小板膜表面及血浆中的抗血小板抗体, 并与ELISA所测结果进行比较。结果:FCM测得14例(70%)ITP患者血小板膜自身抗体PAIgG阳性,9例(45 %)血浆抗血小板抗体阳性。ELISA显示12例(60%)患者PAIgG阳性,7例(35%)血浆抗血小 板抗体阳性。FCM所测结果阳性率稍高于ELISA。结论:FCM可成为血小板自身抗体检测的一项新的快速简便的方法,与ELI SA等方法同时应用可进一步提高ITP患者抗血小板抗体检测的阳性率与可靠性。

    特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种免疫性疾病,患者体 内产生抗血小板自身抗体与血小板抗原结合,导致血小板迅速从循环中清除。检测血小板自 身抗体已成为ITP诊断的一个重要指标。人们已建立了各种抗血小板抗体的检测方法〔 1〕,即以直接法测定血小板结合的Ig,或用间接法测定血浆中能与正常人血小板结合的I g,其中ELISA是最常用的检查方法。流式细胞术(FCM)是一种单细胞定量分析的新技术, 具有快速、灵敏的特点,已广泛应用于基础医学与临床研究。90年代以来,国外开始将FCM 用于ITP自身抗体的研究〔2,3〕。最近,我们建立了ITP自身抗体FCM检测方法,并 与ELISA方法对比,研究其对ITP诊断的价值和意义。

    1 资料与方法

    1.1 研究对象

    20例ITP患者均为本院初诊患者,诊断符合

    1986年全国血栓止血会议制定的标准,其中男6例,女14例,年龄20~62岁(中位年龄33岁) ,均未用过激素、免疫抑制剂及脾切除术等治疗。正常对照组为20例健康志愿者,性别和年 龄与患者匹配。

    1.2 标本制备

    采肘静脉血,以EDTA(Na2)抗凝用200 g离心力离心8 min,上层富血小板血浆(PRP )以TEN洗涤2次,余血以800 g离心力离心15 min,分离取血浆。

    1.3 检测方法

    FCM直接法检测血小板表面抗体:按Macchi等〔4〕方法改进。洗涤血小板以0.01 mol/L PBS悬浮,调整血小板浓度至200×109/L,每管50 μl细胞悬液中分别加等量FITC -羊抗鼠IgG及FITC-羊抗人IgG(上海华美生物公司产品)稀释液,温育30 min,以TEN洗 涤2遍后再加入1 ml PBS重悬。采用EPICS-XL型FCM(Coulter公司产品),选择488 nm波长 的氦氖激发光,根据前向角散射与侧向角散射设定血小板门,测定5 000~10 000个血小板的 荧光阳性百分率及平均荧光强度(MFI)。

    FCM间接法检测血浆中血小板自身抗体:按Stockelberg等〔5〕方法改进。用PBS将O 型健康者洗涤血小板调至200×109/L,每管100 μl与等量血浆标本在37 ℃孵育2 h,用T EN洗涤2遍后,用100 μl PBS悬浮,等分后分别加入FITC-羊抗鼠IgG及FITC-羊抗人IgG, 温育30 min,洗涤,加PBS悬浮,用FCM测定。

    ELISA直接法测定血小板相关IgG:参照文献〔2〕的方法,调整洗涤血小板浓度100× 109/L,以Triton-X100(终浓度1%)4℃破碎离心,将上清液1∶10备用。以羊抗人IgG包 板,封闭后加入血小板稀释破碎液反应,再加入E-羊抗人IgG,洗涤后用OPD显色,490 nm 处测定吸光度(A)值。

    ELISA间接法测定血浆中抗血小板自身抗体:参照文献〔6〕的方法,以O型健康者洗 涤血小板(10×105/孔)包板,用30 g/L白蛋白封闭,再加1∶10稀释的血浆标本温育, 加E-羊抗人IgG,洗涤后用OPD显色,490 nm处测定A值。

    1.4 统计学处理

    正常对照组结果以±s表示,以>+2s定为阳性值。不同方法的 阳性率进行χ2检验。

    2 结果

    FCM检测血小板自身抗体PAIgG:正常对照组的:直接法和间接法的MFI分别为0. 56±0.16和0.73±0.11,荧光百分率分别为(20.63±5.10)%和(3 5.58±7.40)%。本文20例ITP患者中,FCM直接法14例(70%)阳性,间接法9例(45%) 阳性。

    ELISA检测血小板自身抗体PAIgG:正常对照组的;直接法和间接法A值分别为0.147 ±0.038和0.134±0.037。本文20例ITP患者中,直接法PAIgG阳性12例(60%) ,而间接法PAIgG阳性7例(35%)。FCM法结果与ELISA法相比无显著性差异(P>0.05 ),但检测阳性率有增高趋势。同样直接法检测结果与间接法也无显著性差异(P>0. 05),但检测率增高。直接法中,ELISA检测阳性,12例其中FCM检测阳性11例;FCM检测 阳性14例,其中ELISA11例阳性;而间接法中,ELISA检测阳性者,FCM检测均为阳性,FCM检 测9例阳性者中,ELISA检测7例阳性。

    3 讨论

    ITP是一种自身免疫性疾病,系由循环中血小板自身抗体作用于血小板抗原造成血小板破坏 所致〔7〕。其中一部分抗体针对血小板表面多种抗原抑制血小板功能,使出血严重 ;一部分能活化血小板,加剧血小板的减少〔8〕。人们已建立了各种方法检测患者 血小板上及血浆中的抗血小板抗体,这对ITP诊断及监测病情演变有重要的参考价值。但临 床上实用并已普遍开展的只有ELISA等测定方法。但这些方法缺点较多,如操作复杂、费时 或特异性低等。

    FCM是近年来发展起来的一项新技术,具有快速、灵敏的特点,已广泛应用于免疫学、血液 学等多学科领域。国外从90年代开始用于ITP 研究,但国内尚未开展此项工作。本研究应用 FCM和ELISA 监测20例ITP患者血小板及血浆中PAIgG,发现两种方法的结果符合率高,说明F CM检测结果可靠。FCM阳性率较高,可能比ELISA更敏感。

    一般而言,间接法检测率较直接法低,这是由于大多数患者血浆中抗体浓度很低的缘故。本 研究用FCM检测阳性率达45%,表明FCM有相当高的价值。

    FCM简易、快速、敏感,是ITP自身抗体检测的一个临床实用方法,与ELISA合用可进一步提 高阳性率与准确性。但与ELISA方法一样,需要改进检测方法,提高检测的特异性。


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