骨髓增殖性肿瘤的干细胞（一）Adam J. Mead1 and Ann Mullally
MPN疾病—初始体细胞突变
在几乎所有的病例中都定义了MPNs的分子基础。95%的MPN病例，驱动MPN表型发展的突变是由3个基因的体细胞突变引起的：JAK2，CALR，或MPL，特别是这些突变以一种相互排斥的方式发生。在JAK2和MPL中发生的突变是作为点突变实现的（即JAK2V617F和MPLw515/k，各别的），而CALR中的突变则发生在CALR的最后一个exon编码上，导致了+1碱基对移码突变,结果产生了一个新的C-端(羧基端)。最近的研究表明，CALR突变为突变的CALR赋予了一个新功能，从而激活了MPL信号。此外，最近，在所谓的“三阴性”MPN病例中，有19%的人发现了JAK2或MPL中的生殖细胞系和体细胞突变。在此之前，包括LNK、c-CBL 、和SOCS在内的JAK-STAT信号通路的负调控因子，在MPN中也被显示为在低频率下不活跃，这突出了在MPN发病机制中，JAK-STAT信号通路的首要作用。通过逆转录病毒骨髓移植试验，证实了JAK2、CALR和MPL体细胞突变在MPN疾病最初的角色，在这种情况下，每个突变的过量表达就足以在小鼠中产生MPNs。不管怎样，值得注意的是，MPN在所有这些模型中都是多克隆的。最近的研究使用了一种表达了已被证明是来自内源性人类JAK2启动子的人类JAK2V617F的转基因老鼠模型，这表明通过将单个JAK2V617F表达的长寿（LT）-HSC移植到一个受到致命辐射的野生型受体小鼠，可以启动MPN。MPNs的发展只在少数接受长期再造的受者中发生，支持了在单个LT-HSC水平上建模时，JAK2V617F并不总是会启动疾病的概念。
在MPNs中，JAK2V617F突变是否是疾病起因的问题近来也在发酵，在本文后面提到的一系列人类造血作用的研究中，在明显没有血液病的正常人群的周围血液中检测到JAK2V617F突变。JAK2V617F包含在最常见的与突变相关的CHIP中，并且在大多数情况下，JAK2突变是在没有其他与突变相关的恶性血液病的情况下发生的孤立事件，这表明JAK2V617F足以单独产生血液克隆。然而，有趣的是，JAK2V617F-阳性MPNs的患病率明显低于JAK2V617F-阳性的芯片，这表明在许多情况下，JAK2V617F单独可能足够引起克隆造血，但不足以诱导MPNs。这种差异可以部分地解释为，依据哥本哈根的总人口研究观察报告，更高的JAK2V617F等位基因负担与临床MPNs的发展有关，而对于疾病的明显发展，似乎需要一个最小的JAK2V617F等位基因阈值。
然而，由于在哥本哈根的研究中没有对伴随的体细胞突变的存在进行评估，因此无法得出关于JAK2V617F是否足以导致MPNs的明确结论。
同样重要的是要注意到，其他的体细胞遗传改变，例如，TET2的功能突变，可以先于JAK2V617F获得，正如在骨髓恶性肿瘤中TET2的最初描述中所报告的那样，后来的研究证实了这一点。确实，TET2也是一种常见的CHIP基因，和其他后生的基因，例如DNMT3A一样。体细胞突变的，克隆扩张的HSC，导致疾病表型发展的，额外的体细胞突变已被定义为“白血病前期”的HSC，它们在骨髓恶性肿瘤发展中的作用，现在已经明确确定。在MPNs中TET2突变的原始描述及之前所说的JAK2V617F都在验证中。研究还表明，TET2突变可以跟随着JAK2V617F，而获得这些突变的顺序会影响到发病的年龄和MPNs的临床特征。 在已确认的MPNs中获得的TET2突变也已与白血病转化关联，像在其它后生成的基因如ASXL1，拼接基因如SRSF2以及附加的基因，包括IDH1/2、TP53、NRAS和runx1当中一样有突变。有趣的是，起源于JAK2V617F突变MPNs的急性髓系白血病（AML）仅仅保留了当初的JAK2V617F等位基因的一半，表明在MPN干细胞中获得的额外体细胞突变（例如，JAK2，CALR，或MPL）并不是转化成AML唯一的途径。出自于前MPN克隆（缺乏MPN表型驱动突变）的白血病转化可以通过MPN克隆分泌的炎性细胞因子来促进，特别是在MF的背景下（参见“MPN干细胞龛”）。
注：
1.Chip技术作为生命科学的最新技术近些年来发展迅速，被广泛的应用于各个生命科学领域，包括疾病预测与诊断、基因突变检测、遗传学产前诊断等临床应用中。芯片技术包括最常见的DNA芯片（基因芯片）、蛋白芯片、microRNA芯片及最新开放的新型芯片等。chip-chip是染色质免疫共沉淀技术（Chip）及与芯片方法的结合。
2.Tet2(tet癌基因家族成员2)是新发现的骨髓恶性肿瘤患者4q24上的肿瘤抑制基因,有发生功能缺失突变的潜能。最近研究表明,在真性红细胞增多症(polycythemiavera,PV)、原发性血小板增多症(essentialthrombocy-themia,ET)、骨髓纤维化(myelofibrosis)、系统性肥大细胞增多症(systemicmastocytosis,SM)和骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome,MDS)等骨髓恶性疾病中均可发现tet2突变的存在,但tet2在恶性血液系统疾病中的作用仍需要通过大量的前瞻性研究来探索。
3.DNMT3A ：DNA 甲基转移酶3A（DNMT3A）是表观遗传修饰相关的重要基因之一，承担着DNA从头甲基化的修饰工作。DNMT3A基因突变可见于多种血液系统肿瘤，尤其在急性髓系白血病（AML）中发生频率较高，并提示预后不良。近年来的研究显示，DNMT3A等表观遗传相关基因异常在血液肿瘤的发生发展中起重要作用，是AML 发病的第Ⅲ类致病基因。
骨髓增殖性肿瘤的干细胞（二）
MPN疾病的体细胞突变对MPNs起源细胞的影响是什么？
许多证据支持这样一种概念，即获得MPN初始化突变的原始目标细胞是位于造血层次结构顶端的LT-HSC对MPN发展很重要的关键体细胞突变和生长因子受体：（A）造血发展的简化“路线图”。（B）在不同的干、祖细胞和前体细胞群中，主要生长因子受体的分布。表明了JAK2V617F、CALR或MPL突变对每个种群的潜在影响。 在MPN患者中，JAK2V617F突变可在免疫表型定义（CD34+CD38-）的LT-HSC中检测到，并且，在所有成熟的细胞谱系中，表明突变是从多潜能细胞获得的。通过对MPN病人的造血菌落进行基因型的分类，也证明了CALR突变在最早的系统树中存在。来自基因小鼠模型的额外证据进一步支持了Jak2V617F疾病启动细胞只存在于免疫表型中定义的LT-HSC隔间的观点，而Jak2V617F多潜能祖细胞缺乏疾病传播的潜力。在通过一个HSC获得MPN初始突变之后，明显的MPN表型的发展需要克隆扩充，这是通过MPN干细胞的选择性优势授予的，而非它们正常的复制品（图2）。
与急性白血病相反，骨髓祖细胞可以获得异常的自我更新，MPNs的起始和传播，只能由居住在免疫表型定义的LT-HSC隔间中的细胞维持。在MPN发展过程中，从正常造血，随后在单个HSC中获得MPN初始突变的关键步骤。突变的HSC比普通HSC具有选择性优势，并促进骨髓分化，最终导致骨髓增殖表型。扩大的、异常的骨髓克隆破坏了骨髓微环境，促进了自我强化的恶性的龛，使MPN干细胞优于正常的HSC，并最终动员MPNHSC进入周边血液（PB）。
MPN表型驱动突变对HSC池扩张的影响，在粒细胞系诊断中可以从体细胞突变等位基因负荷推断出来。在这方面，比较慢性MPNs阶段（即真红[PV]和原发血小板增多症[ET]）以及随后的MPNs疾病更高级阶段（也就是骨髓纤维化[MF]）的JAK2V617F突变等位基因负荷是有益的。对于PV，在诊断中，JAK2V617F突变的等位基因负荷通常很低，在ET中，JAK2V617F杂合子克隆可以在数年内保持稳定。最近有证据表明，纯合子的JAK2V617F克隆并不一定会扩大。在对PV，ET和MF患者的研究中，观察的一致性是CD34+CD38-HSC隔间没有出现在PV和ET患者中，但是存在于MF患者中。另一项研究表明，与PV和ET相比，在MF患者的CD34+细胞隔间中，JAK2V617F的等位基因负荷较高。有趣的是, MF患者CD34+细胞隔间中JAK2突变细胞的这种扩张，被发现独立于JAK2V617F的纯合性。拿MF和PV或ET相比较，表明在MF中CD34+隔室克隆扩张是由其他体细胞遗传学驱动的 (例如,外源性的功能缺失突变)。与此相反，在ET诊断时，在粒细胞中测定的CALR突变等位基因分数通常为40%到50%，这表明杂合突变的CALRHSC快速地占主导地位。与这一观察结果一致的是，以CALR突变与jak2突变患者相比，MPNs的发病年龄更小。
利用基因小鼠模型和患者派生的异种移植模型，在活体中研究了MPN-起始突变对HSC功能的影响。特别是JAK2V617F已经成为深入研究的对象，而JAK2V617F基因小鼠模型已经在其他地方得到了详细的评估。尽管这些模型已经证明了JAK2V617F本身就足以产生MPN，并且已经证明了致癌的JAK2V617F信号在非自我更新的造血细胞上没有赋予自我更新能力，JAK2V617F对HSC的自我更新的影响（诸如竞争性种群恢复试验）是高度可变的，取决于用于生成特定鼠模型的基因靶向方法。最近，利用转基因的JAK2V617F小鼠模型，在一系列移植试验中，用JAK2V617F高表达的单个LT-HSC演示了一个衰竭表型，证明了在单个LT-HSC中的JAK2V617F表达水平对重组能力的影响，与JAK2V617F低表达单个LT-HSC相比，后者保持了长期的种群恢复能力。Tet2和Ezh2两者的丢失已经被证明在基因小鼠模型中，可以增强病态传播MPN干细胞JAK2V617F的种群恢复能力，在Ezh2丢失的情况下，增强种群恢复通过重新激活胚胎lin28b程序来调节。
在异种移植中的MPN研究已经发现，在PV和ET移植患者中，JAK2V617F突变的CD34+细胞相对较差，而来自外周血或MF患者脾脏的CD34+细胞显示出持续不变的移植成活率。并且，在脾脏CD34+细胞的实例中，给次级接受者的一系列移植已得到了实现。事实是，JAK2V617F严重联合免疫缺陷（SCID）再生细胞（SRC）并未获得在CD122-耗尽的NOD/SCID小鼠中不会比野生型SRC更大的增殖优势。这表明，JAK2V617F不是在HSC水平上克隆扩张的强力驱动因素。然而，在对这些结果的解释中，有一个重要的预告是，人类细胞因子受体（表达在移植的CD34+细胞上）和鼠科细胞因子(由接受鼠骨髓产生的)之间的不相容可能会对这些研究中的JAK2V617F SRC活动产生显著影响。与隐藏着JAK2V617F 克隆的CD34+细胞相比，TET2和JAK2V617F的并发突变已被证明可以增加CD34+细胞的NOD-SCID种群恢复能力。为了克服异种移植中的物种不相容问题，最近采用了一种人源化的骨髓小骨片骨移植模型来研究MPN干细胞。在本研究中，CD34+隔间被分为CD34+CD38+和CD34+CD38lo/亚分支，并且仅仅在用CD34+CD38lo/细胞小骨片移植体中观察到成活移植体，证实了MPN-起始群组仅包含在免疫表型定义的LT-HSC分组中。
注：
1. 体细胞突变是指除性细胞外的体细胞发生的突变。不会造成后代的遗传改变，却可以引起当代某些细胞的遗传结构发生改变。绝大部分体细胞突变无表型效应。在植物中某些体细胞突变可导致叶形和枝形发生一定改变。
2. 点突变指只有一个碱基对发生改变。广义点突变可以是碱基替换，单碱基插入或碱基缺失；狭义点突变也称作单碱基替换（base substitution）。碱基替换又分为转换（transitions）和颠换（transversions）两类。点突变具有很高的回复突变率。
3.基因移码突变是指DNA片段中某一位点插入或丢失一个或几个（非3或3的倍数）碱基对时，造成插入或丢失位点以后的一系列编码顺序发生错位的一种突变。它可引起该位点以后的遗传信息都出现异常。发生了移码突变的基因在表达时可使组成多肽链的氨基酸序列发生改变，从而严重影响蛋白质或酶的结构与功能。
4.碱基是指嘌呤和嘧啶的衍生物，是核酸、核苷、核苷酸的成分。DNA和RNA的主要碱基略有不同，其重要区别是：胸腺嘧啶是DNA的主要嘧啶碱，在RNA中极少见；相反，尿嘧啶是RNA的主要嘧啶碱，在DNA中则是稀有的。
5.碱基对形成DNA、RNA单体以及编码遗传信息的化学结构。组成碱基对的碱基包括A、G、T、C、U。严格地说，碱基对是一对相互匹配的碱基（即A：T，G：C，A：U相互作用）被氢键连接起来。然而，它常被用来衡量DNA和RNA的长度（尽管RNA是单链）。
6.羧基端由多个氨基酸残基按一定顺序所组成的多肽链，通常在一端含有一个游离的α氨基，称为氨基端或N末A端或N端，另一端含有一个游离的α羧基，称为羧基端或CA末端或C端。
7. NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠是在SCID(重症联合免疫缺陷)小鼠的基础上与非肥胖性糖尿病小鼠(NOD/Lt)品系回交的免疫缺陷鼠。NOD/SCID小鼠既有先天免疫缺陷,又有T和B淋巴细胞缺乏,各种肿瘤细胞可以植入,且较少发生排斥反应及移植物抗宿主病(GVHD),所以NOD/SCID小鼠逐渐成为血液学实验研究的有用工具.
骨髓增殖性肿瘤的干细胞（三）
骨髓干细胞龛
骨髓龛提供了对HSC功能至关重要的微环境信号，在理解HSC龛的细胞组成方面取得的进展促进了对这些不同成分在骨髓肿瘤发展过程中被干扰的研究。事实上，许多证据表明，仅骨髓龛的靶向断裂就足以在活体中诱发MP
虽然，随着MPN的进展，初始MPN突变的获得，起始于很可能发生在单个HSC未受干扰的niche中，不断扩大的恶性克隆，对骨髓龛成分表现出非细胞固有的影响，并且来自小鼠模型的证据表明这种龛的破坏有利于存活，而且MPN干细胞的扩展超越了正常的HSC，导致了所谓的恶性“自我强化”的龛。例如，jak2v617f阳性HSC已经被证明，通过异常产生的白介素-1b引起骨髓神经损伤，这反过来又导致了间充质干细胞数量的减少和加速了MPN的进展，最后，临床试验的高潮，是测试了MPN患者的β3-肾上腺素能激动剂。确实，更高级的MPNs的特征是由炎细胞因子促进的骨髓纤维化的发展，包括转化生长因子（TGF-β）和肿瘤坏死因子α（TNFα)，它们是由异常的骨髓单核细胞和巨核细胞群产生的。转化生长因子β和TNFα两者也被认为是正常HSC的负调控因子，在逆转录病毒的JAK2V617F模型中，TNFα被证明可以促进JAK2V617F突变造血细胞的优先扩张。MPN患者的骨髓龛也受到干扰，这是血管生成增强的结果，正如MPN患者的骨髓微血管密度升高所证明的那样，可能是血管内皮生长因子表达增加的结果。被破坏的龛也会导致HSC被转移到周围血和脾脏中，从而导致脾脏的髓外造血，这是更高级的MPNs的一个基本特征。
此外，在MPNs中骨髓微环境的破坏也可能促进向白血病的转化，正如一项MF-异种移植研究中所证明的那样，在该研究中注意到老鼠起源AML的高频率。在这项研究中，鼠类 AML的发展被局限于MF-异种移植组（在正常骨髓或脐带血细胞的异种移植中没有发现），这表明由MF细胞群引起的旁分泌信号在活体正常老鼠细胞中导致了白血病的发生。最近的研究表明，在促进MPNs的DNA损伤和疾病进展方面，已经凸显脂钙蛋白是一种重要的旁分泌因子。
最后，一些调停骨髓纤维化、炎症信号和龛失调的途径有可能被用于治疗目标。模拟龛破坏的新方法，诸如在异种移植试验中，使用人类骨髓小骨片的方法，将有助于进一步探索在MPNs中龛破坏的潜在机制，并且试验新的治疗干预措施。
MPNs起源于并且繁殖于罕见的自我更新干细胞的发现，十分类似正常LT-HSC表型代表着一个挑战和一个治疗机会。机会在于，有效地瞄准MPN疾病传播的干细胞不仅是必需的，而且可能足以根除这种疾病并达到治愈的目的。无论如何，在骨髓恶性肿瘤中，已经被证明干细胞群的选择性抵抗成为能够诱导细胞遗传学缓解的治疗方法-甚至在慢性粒细胞性白血病（CML）中最成功的靶向治疗也无法根除大多数患者的白血病干细胞。白血病干细胞的选择性治疗性抵抗，至少在一定程度上与它们与祖细胞相比的显著宁静状态有关。然而，由于体细胞突变为MPN干细胞提供了竞争优势，因此，在原则上，调节这种选择性优势的途径应该服从于治疗目标。
目前，对MPN唯一有效的治疗方法，是能够根除MPN干细胞，是同种异体造血干细胞移植。
尽管在MPNs领域取得了巨大的进步，特别是在我们对MPNs基因基础的理解以及使用JAK2抑制剂的分子靶向治疗的发展，我们对那些MPN干细胞在骨髓中占有克隆支配优势的机制的认知仍有很大的差距。此外，最近对CHIP的研究表明，我们对限制和促进从jak2v617f驱动的克隆造血作用到jak2v617f诱发的MPN的转变过程的认知存在额外的不足。这种对MPN干细胞生物学基础的不完全理解，至少在一定程度上是，目前的治疗方法未能有效针对MPN干细胞，这是成功治愈的关键一步。由于大多数失败的临床试验未能适当的纳入生物样本银行，以便将来对疾病干细胞进行分析，这进一步阻碍了这一领域的进展。在对干细胞区室的分析重点上并入生物学辅助终点的临床研究，诸如对HSC分子应答的评估，将为未来的研究提供非常宝贵的资源。最终，有效地根除MPN干细胞可能需要一种多目标的方法，既要解决细胞内在的，也要处理支持MPN干细胞传播的细胞外机制。
发表于 2020-1-7 09:03:13
发表于 2020-1-11 15:33:11
